Dear kawan……

Kali ini kita akan membahas mengenai bagaimana memilih fase gerak untuk kromatografi lapis tipis. Memilih solven sebagai sistem fase gerak merupakan permasalahan tersendiri bagi para peneliti, terutama peneliti pemula. Masalah yang dihadapi adalah komposisi fase gerak mana yang akan kita gunakan untuk mendapatkan hasil pemisahan terbaik. Biasanya permasalahan menentukan fase gerak ini terjadi oleh para peneliti yang berasal dari bahan alam, analisis,  maupun sintesis.

Berikut tips - tips praktis yang dapat digunakan :
1. Cari literature (skripsi, thesis, desertasi, farmakope, maupun jurnal/publikasi), ada belum fase gerak yang sama untuk elusi senyawa yang kita gunakan. Jika ada berarti coba saja menggunakan fase gerak tersebut. Terkadang literature sistem fase gerak milik sistem HPLC dapat juga membantu. Apabila hasil kurang memuaskan namun sudah menunjukkan hasil, maka modifikasi komposisinya. Langkah memodifikasi adalah Jika fase diam lebih polar daripada fase gerak, maka apabila rF yang dihasilkan terlalu tinggi, maka fase gerak dapat ditambah polaritasnya atau apabila rF yang dihasilkan terlalu tinggi maka fase gerak dapat dikurangi polaritasnya.

2. Jika fase gerak yang dipilih berdasarkan literature tidak memberikan hasil yang baik bahkan setelah di modifikasi, atau tidak menemukan literature maka gunakan satu solven murni dengan kekuatan eluasi sedang.
3. jika hasil pengembangan menunjukkan bahwa sistem satu solven   tidak menunjukkan pemisahan yang baik  (setelah mencoba berbagai sistem), maka kombinasi solven dapat dilakukan. Konsep  yang paling penting adalah solven terdiri dari satu solven polar (semi polar) dan satu solven non polar dimana keduanya dapat bercampur. gunakan campuran dengan perbandingan pertama kali 1 : 1. dan rubah komposisi setelah melihat rFnya apakah terlalu tinggi atau terlalu rendah. Pemilihan solven  Dapat di bantu dengan deret eluetropik berikut :

 
(kita akan bahas bagaimana detail penggunaan deret eluotropic series diatas di blog selanjutnya)

4. Apabila kita telah mengetahui kelarutan dari senyawa yang akan di KLT, maka senyawa non polar dapat menggunakan solven non polar (adsorbtion chromatography), dan senyawa polar dalam solven polar (partition kromatograpi).
5. Tailling sering terjadi, misal pada komponen asam dan basa. Hal ini dapat di minimalkan dengan memilih pH yang sesuai (gunakan asam asetat glasial atau larutan amoniak) atau menggunakan garam inorganik atau organik (disebut tailing reducers) .
6. terkadang dengan menambahkan sejumlah kecil komponen bersifat basa seperti larutan ammoniak dapat memisahkan bahan dengan berbagai komponen yang ada didalamnya.

6. Gunakan sistem solven yang selalu baru untuk meng KLT, dan gunakan hanya sekali saja untuk pengembangan dan chamber hendaknya jangan dibuka baik saat penjenuhan maupun sebelum proses pengembangan selesai.
7. jangan percaya dengan berbagai literature sebelum mpraktekkan sendiri. Hanya dengan konfirmasi dengan bekerja sendiri maka kita akan mendapatkan hasil yang diharapkan atau tidak.
8. Senyawa dikatakan murni secara KLT apabila hanya terdapat satu bercak pada tiga fase gerak yang berbeda kepolarannya.
9. Adapun solven yang digunakan untuk fase gerak  hendaknya murni (pro analisis), stabil, low viscosity, linear partition isotherm, menguap terhadap tekanan yang tidak terlalu rendah dan tidak terlalu tinggi, toxicity diharapkan kecil.

10. Untuk menganalisis  ekstrak etanolik kasar, terdiri dari senyawa apa saja, biasanya Plate KLT yang telah ditotoli bahan akan di elusi berulang, yakni elusi menggunakan berbagai sistem fase gerak mulai dari yang non polar kearah polar. Berikut fase gerak yang digunakan untuk meng elusi plate tersebut :
  Gunakan beberapa fase gerak ini :
    fase gerak yang mewakili non polar hexane : etil asetat (70 : 30)
    fase gerak yang mewakili semi polar   etil asetat :etanol : air (100 :26:10) atau kloroform :etanol : air (65 : 25 :4)
                                                                 
fase gerak yang mewakili lebih semi  polar Kloroform : metanol (8 : 2)

    fase gerak yang mewakili senyawa yang sangat polar   BAW (Butanol : asam asetat : air (4 :1: 5). terdapat dua lapisan, maka harus hati hati, diambil fase atas (butanol jenuh dengan air). Tetapi bisa juga menggunakan sistem yagn belum terjenuhi yakni (3 :1 :1).
apabila tidak cocok menggunakan BAW, maka dapat menggunakan Toluen : butanol : asam asetat : air (2 :2 :1 :5)

jika tidak bisa naik, sebaiknya menggunakan kromatografi kertas
Apabila ekstrak merupakan infusa, maka fase gerak non polar hexane dan etil asetat tidak usah digunakan.

11. trial and error terkadang juga sangat membantu

12. Bagaimana menentukan kekuatan kombinasi solven dalam memisahkan suatu bahan dengan bahan lainnya?

Apabila KLT diatas merupakan Normal Phase Chromatograpy (fase diam lebih polar daripada fase gerak), permasalahannya adalah antara senyawa I dan senyaw II belum memisah secara baik (rFnya masih kurang jauh), sedangkan harapannya senyawa tersebut akan di pisahkan menggunakan Kromatograpi preparatif dimana diharapkan antara senyawa I (Rf = 0, 3) dengan senyawa II (Rf = 0, 45) hendaknya terpisah secara jauh. Fase gerak yagn digunakan adalah chloroform 80 % : metanol 20 %. Maka bagaimana komposisi yang lebih baik agar kedua senyawa itu dapat terpisah lebih jauh?

sebelum kita menyelesaikan kasus tersebut, maka kita masuk ke teori terlebih dahulu.

Optimasi komposisi fase gerak dan polaritas sangatlah penting agar diperoleh pemisahan yang baik. Lantas pertanyaannya adalah, bagaiman kita mampu mengoptimasi komposisi fase gerak tersebut sehingga di peroleh polaritas yang sesuai sehingga dapat memisahkan satu komponen dengan komponen lainnya?

Syneder’s polarity index memberikan suatu ilmu yang sangat penting dalam hal ini, yakni sebuah rumus menghitung polaritas campuran dalam kombinasi solven :

dimana P’ab adalah index polaritas dari fase gerak yang terdiri dari dan adalah volume fraksi dari solven A dan solven B. P’a dan P’b adalah polaritas index dari solven murni A dan B.

dari teori ini, mari kita hitung berapa polaritas P’klororom-etanol ?

P’kloroform (lihat ditabel) = 4,1

P’metanol (lihat tabel)      = 5,1

P’klorofrom-metanol = 0, 8 * 4, 1 + 0, 2 * 5, 1  = 4, 3

karena fase diam polar, dan secara logika senyawa I memiliki sifat lebih polar daripada senyawa II (karena senyawa I lebih terikat kuat di fase diam daripada fase gerak melihat dari rFnya yang lebih kecil) maka diperlukan fase gerak yang lebih non polar (index polaritinya lebih kecil) agar senyawa II dapat  bergerak lebih jauh sehingga lebih memisah dengan senyawa I.

Maka Coba dengan index polarity dengan 4, 15

4, 15 = x * 4.1 + (1- x) * 5.1

4, 15 = 4, 1 x + 5, 1 – 5,1 X

4, 15 – 5, 1 = 4, 1 x – 5, 1 x

- 0, 95 =  -1 x

x = 0, 95

berarti kloroform 0, 95 * 100 = 95 %

           metanol 100 – 95  = 5 %

dengan komposisi tersebut di cobakan sebagai fase gerak, bagaimanana hasil pemisahan. Apabila masih kurang baik, maka dapat digunakan fase gerak yang memiliki index polaritas yang lebih rendah lagi. Apabila tidak bisa dikombinasi antara kloroform maupun metanol maka dapat menggunakan fase gerak tunggal terlebih dahulu yang memiliki index polaritas lebih rendah daripada diatas.  misalnya saja dietil ether.

http://www.monzir-pal.net/Bioseparation/Lectures/L38.pdf

http://www.chemical-ecology.net/java/solvents.htm

Elke-Hahn-Deinstrop, 2007, Applied Thin-Layer Chromatography-Best Practice and Avoidance of Mistakes., Second, Revised and Enlarged Edition, Wiley-VCH